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發(fa)布時間：2022-11-01 11:33 信息(xi)來源： 閱(yue)讀(du)次(ci)數： 次(ci)
成(cheng)瘤(liu)性檢(jian)查，是指為確定細胞基質在動物體內是否能夠形成腫瘤，對細胞特性進行的鑒定。與致瘤性檢查不同的是，致瘤(liu)性檢查是指(zhi)確定(ding)細胞(bao)基(ji)質中是否存在(zai)可(ke)使細胞(bao)永生(sheng)化并具有形成腫瘤(liu)的因子。成瘤性(xing)檢查針對(dui)的是細(xi)胞基質，致瘤性(xing)檢查針對(dui)的是細(xi)胞因(yin)子。
需要進行成瘤性檢查的細胞
1. 新建細胞系/株(zhu)以及新型細胞基(ji)質。
2. 某些傳代(dai)細胞已證明在一定(ding)代(dai)次內不具(ju)有(you)成瘤性(xing)，而超(chao)過一定(ding)代(dai)次則具(ju)有(you)成瘤性(xing)（如Vero）。
3. 用于疫(yi)苗生(sheng)產的細(xi)胞(bao)(bao)系(xi)/株(zhu)應進行(xing)成瘤性檢查，但當未經遺傳修飾的二倍體細(xi)胞(bao)(bao)被證明無成瘤性后，可以不(bu)作為常規檢查要求(qiu)。
注(zhu)：已證明具有成瘤性的傳代細胞（如BHK21，CHO，C127等），或細胞類型屬成瘤性細胞（如雜交瘤細胞等），用于生產治療性產品時可以不再做成瘤性檢查。
檢查方法
目前使用比較廣泛的成瘤性檢查方法有動物接種法（體內）和(he)軟瓊脂克隆形成實驗（體外）。其中，體(ti)(ti)內(nei)法為評價的(de)標(biao)準，但對(dui)某些細胞(bao)而言，體(ti)(ti)外法的(de)結果也可以作(zuo)為細胞(bao)成瘤(liu)性檢查的(de)參(can)考(kao)，尤其是低代次、在動(dong)物體(ti)(ti)內(nei)無成瘤(liu)性的(de)傳代細胞(bao)系(xi)。
1?
動(dong)物接種(zhong)法
將待檢(jian)測(ce)細(xi)胞(bao)(bao)接(jie)(jie)種于(yu)皮下或者肌肉內注射(she)。至少觀察16周接(jie)(jie)種部(bu)位是(shi)否(fou)(fou)有進(jin)(jin)行性結(jie)節形(xing)成(cheng)，對出現的(de)結(jie)節開始消退的(de)動(dong)物(wu)，應在(zai)(zai)觀察期(qi)末處死。不能形(xing)成(cheng)進(jin)(jin)行性結(jie)節的(de)細(xi)胞(bao)(bao)，不視為(wei)(wei)具有成(cheng)瘤性。通常(chang)用 HeLa 或 HeLa S3細(xi)胞(bao)(bao)或其他已知成(cheng)瘤性細(xi)胞(bao)(bao)作陽(yang)性對照，且對照組(zu)至少設(she)10只動(dong)物(wu)，試(shi)驗才視為(wei)(wei)有效。在(zai)(zai)觀察期(qi)末，處死所有動(dong)物(wu)，對注射(she)部(bu)位及其他部(bu)位 (如心臟、肺、肝、脾、腎、腦及局部(bu)淋(lin)巴結(jie))進(jin)(jin)行觀察和組(zu)織(zhi)病理學檢(jian)查，判(pan)(pan)斷是(shi)否(fou)(fou)有接(jie)(jie)種細(xi)胞(bao)(bao)增生，進(jin)(jin)一步判(pan)(pan)定接(jie)(jie)種細(xi)胞(bao)(bao)是(shi)否(fou)(fou)形(xing)成(cheng)腫(zhong)瘤或有轉移瘤。
?
結(jie)果判斷(duan)：
● 如待檢(jian)細胞(bao)(bao)接(jie)種組10只(zhi)(zhi)裸鼠中至少有2只(zhi)(zhi)在注(zhu)射部(bu)位(wei)或(huo)轉移部(bu)位(wei)形成(cheng)(cheng)瘤(liu)，并且(qie)組織病理學及基因(yin)型分析顯(xian)示形成(cheng)(cheng)瘤(liu)的細胞(bao)(bao)性質與接(jie)種的細胞(bao)(bao)一致時，則可判定為待檢(jian)細胞(bao)(bao)具有成(cheng)(cheng)瘤(liu)性，視(shi)為陽性。
● 如待(dai)檢細胞(bao)接種組10只(zhi)裸鼠出現結節(jie)開始消(xiao)退，應(ying)在觀察期末(mo)處死。不能形(xing)成(cheng)進行性結節(jie)的細胞(bao)，不視為(wei)具有(you)成(cheng)瘤(liu)性。
2?
軟(ruan)瓊脂克隆形(xing)成實驗
使(shi)用(yong)(yong)低熔點(dian)瓊脂模擬細胞(bao)(bao)(bao)在體內的(de)微(wei)(wei)環境培(pei)(pei)養(yang)(yang)細胞(bao)(bao)(bao)，通常(chang)使(shi)用(yong)(yong)其它已知具(ju)有成瘤性的(de)細胞(bao)(bao)(bao)作為陽(yang)性對照，對照組(zu)與實驗組(zu)同步操作。常(chang)規(gui)培(pei)(pei)養(yang)(yang)3周(zhou)左右，培(pei)(pei)養(yang)(yang)過程中可視(shi)情況適當地補充細胞(bao)(bao)(bao)培(pei)(pei)養(yang)(yang)液，直到陽(yang)性組(zu)在顯微(wei)(wei)鏡(jing)下明(ming)顯觀(guan)察到大量細胞(bao)(bao)(bao)集落，培(pei)(pei)養(yang)(yang)終(zhong)止(zhi)。使(shi)用(yong)(yong)4%多(duo)聚甲醛(quan)固定，結晶紫(zi)染色，在顯微(wei)(wei)鏡(jing)下觀(guan)察并(bing)拍照記錄。
?
結果判斷：
● 陽(yang)性組沒有形成(cheng)明顯的大量(liang)細胞集落或(huo)者(zhe)(zhe)細胞在培養過程中或(huo)是死亡裂(lie)解，又或(huo)者(zhe)(zhe)被污染(ran)，則系統對(dui)照不(bu)成(cheng)立。
● 陽(yang)性組形成明顯(xian)的大量細胞(bao)集落，則系統(tong)對照成立。
● 待檢樣(yang)(yang)品(pin)沒(mei)有(you)形成(cheng)(cheng)(cheng)明(ming)顯(xian)的細(xi)(xi)胞(bao)(bao)集落，則判斷樣(yang)(yang)品(pin)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)沒(mei)有(you)體外成(cheng)(cheng)(cheng)瘤性(xing)(xing)；待檢樣(yang)(yang)品(pin)形成(cheng)(cheng)(cheng)明(ming)顯(xian)的大量細(xi)(xi)胞(bao)(bao)集落，則判斷樣(yang)(yang)品(pin)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)具有(you)體外成(cheng)(cheng)(cheng)瘤性(xing)(xing)。
指導原則
歐洲EMA、美國FDA以及WHO針對干細胞、體細胞、成體干細胞、轉基因細胞、基因治療產品以及生產用動物細胞培養物等發布了多項指導原則。EMA在《人體細胞醫療產品的指導原則》中表示“如果可以預見細胞轉(zhuan)化風(feng)險則(ze)應(ying)該展開(kai)成瘤性(xing)研究，重點檢測(ce)其增殖能力以及染(ran)色(se)體完整(zheng)性(xing)”，在《干細胞醫療產品反思文件》中提到“多能干(gan)細(xi)胞(bao)和體(ti)干(gan)細(xi)胞(bao)都(dou)存在腫(zhong)瘤形(xing)成風險，培養條件可能會嚴重影響干(gan)細(xi)胞(bao)的基(ji)因(yin)組的不穩定，延(yan)長(chang)細(xi)胞(bao)培養有助于評估成瘤性和染色體(ti)穩定性”。
FDA指導原則認為控制hESC衍生(sheng)的細(xi)(xi)胞(bao)(bao)產(chan)品中未分(fen)化(hua)的ESC或其他細(xi)(xi)胞(bao)(bao)雜(za)質水平(ping)是成(cheng)瘤(liu)性(xing)風(feng)險評價的主(zhu)要方面，采用細(xi)(xi)胞(bao)(bao)增殖測定法和軟瓊脂集(ji)落(luo)形成(cheng)法測定惡性(xing)轉化(hua)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)，以(yi)檢測最終產(chan)品中的雜(za)質細(xi)(xi)胞(bao)(bao)是否(fou)超過了最小腫(zhong)瘤(liu)產(chan)生(sheng)劑(ji)量。FDA還(huan)重(zhong)點討(tao)論了臨床前實(shi)驗(yan)物種的選擇和動物模型(xing)的預測能(neng)力，以(yi)評估(gu)植入(ru)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)到達移(yi)植部位(wei)微環境中是否(fou)形成(cheng)腫(zhong)瘤(liu)，以(yi)及引(yin)起宿主(zhu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)和植入(ru)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)在(zai)各組(zu)織器官中發生(sheng)腫(zhong)瘤(liu)轉化(hua)的風(feng)險。
后臺回復“成(cheng)瘤性檢查”，獲(huo)取相關(guan)指導文件。
武漢珈創生物相關服務
武漢(han)珈創(chuang)生(sheng)物(wu)技(ji)(ji)術(shu)股份有限(xian)公司，創(chuang)建于2011年，是(shi)一家集生(sheng)物(wu)技(ji)(ji)術(shu)服務與研發(fa)為一體的高新技(ji)(ji)術(shu)企(qi)業，專注于為生(sheng)物(wu)藥品/制品的生(sheng)產企(qi)業及研發(fa)機構提供各(ge)類細(xi)胞（含重組細(xi)胞、干(gan)細(xi)胞、免(mian)疫細(xi)胞等）及原輔料的質量檢(jian)測、病(bing)毒清除工藝驗證技(ji)(ji)術(shu)服務。
質量檢測服務
武漢珈創生物可按相關法規或指導原則提供各類細胞基質的(de)成瘤性檢查服(fu)務，且有多種檢測方法可供選擇如動物體內接種法（裸鼠）、軟瓊脂克隆形成試驗、端粒酶活性檢測等，至今已完成數萬(wan)批次的細胞及產(chan)品(pin)檢(jian)測服(fu)務。
定制化服務
針對特殊需求(qiu)，我們還可提供定制化的檢測服務，歡迎新老客戶前來咨詢。
參考(kao)資(zi)料：
1、屈哲,林志,霍桂桃,侯田田,楊艷偉,張頔,耿興超,李波,霍艷.細胞治療產品的成瘤性和致瘤性風險評價.Chinese Journal of New Drugs 2021,30(19)
2、Ken Kono，Nozomi Takada.Characterization of the cell growth analysis for detection of immortal cellular impurities in human mesenchymal stem cells.Biologicals 43 (2015) 146e149
3、Nozomi Hasebe-Takada , Ken Kono.Application of cell growth analysis to the quality assessment of human
4、cell-processed therapeutic products as a testing method for immortalized cellular impurities .Regenerative Therapy 5 (2016) 49e54
5、Shinji Kusakawa.Ultra-sensitive detection of tumorigenic cellular impurities in human cell-processed therapeutic products by digital analysis of soft agar colony formation.scientific reports
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