4.  CART細胞結構

CAR結構包含

1. 抗體的單鏈可變區（scFv）
2. 非信號胞外區
3. 與scFv鏈接的鉸鏈區
4. 跨膜區
5. T細胞受體胞內CD3ζ區
6. 共刺激因子結構域

四代CAR的發展

• 第一代CART誘導T細胞激活僅通過cd3ζ信號域激活
• 第二代CART中增加了共刺激結構域
• 第三代CART增加兩個共刺激結構域
• 第四代CART增加酶、細胞因子和共刺激配體

5.  T細胞擴增

在CART細胞擴增過程中，細胞數量不斷增加，培養基體積增大，必須通過更多或更大的組織培養瓶，這極大地復雜化了制造過程，并且它無法實現大規模的生產。

靜態培養袋，允許較少的手動開放處理，管道連接可以使其在無菌條件下進行。

另一種方法 使用生物反應器，如Xuri細胞擴增系統和Wave生物反應器系統，利用灌注機制添加營養物質以及去除生長抑制物質，從而簡化了制造過程。

6.  細胞因子刺激

細胞因子在工藝中使用，作為刺激信號，對于CART細胞質量，表型等產生重要影響。主要是γ鏈細胞因子：IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, IL-21。常用IL-2 或者IL-7,同時使用/或者不適用IL-15.

諾華Yescarta使用IL-2，但是IL-2會導致分化和耗竭的T細胞表型。IL-7/IL-15可以增強T細胞活化和增殖，二者聯合使用可以增加未分化CART（TN，TSCM）的存活和維持。單獨添加IL-15也會增加耗竭表型，及抗凋亡活性。

和IL-2和IL-15比較，IL-21可以增加CD62L表達，增加抗腫瘤活性。

7.  抑制特定的信號通路

主要靶向GSK3β, mTOR, AKT, 和PI3K：

• GSK3β阻斷T細胞分化，產生更多的TSCM

• mTOR inhibitor rapamycin增加CD62L表達

• 體外AKT抑制劑也表現出增加T細胞抗腫瘤活性

• PI3K抑制劑idelalisib，降低調節性T細胞，逆轉腫瘤免疫耐受，增加低分化CART細胞數量

8. 冷凍保存

冷凍保存CART細胞長達90天，不影響細胞的活力。使用前37℃過夜，可以恢復CART細胞活力。