支原體能夠在特定的固體瓊脂培養基上形成經典的“油煎荷包蛋”式的菌落，因此可以在固(gu)體培養(yang)基上(shang)培養(yang)支(zhi)原體，通過觀察菌落形態以判斷是(shi)否存在支(zhi)原體污染。這(zhe)是(shi)(shi)最直(zhi)觀的(de)方(fang)法，也是(shi)(shi)最早的(de)方(fang)法，但人(ren)們后來發現(xian)有很多支原體難以在固體培養基上(shang)形成菌落，因(yin)此(ci)，該法容(rong)易造成假(jia)陰性結(jie)果。

支原體在液體培養基中也能夠較好地生長，在支原體數目增(zeng)長到一定程度之后，培養(yang)基(ji)中(zhong)的PH值會發生顯著變(bian)化，如果在培養(yang)基(ji)中(zhong)添加指示劑，這(zhe)種變(bian)化會非(fei)常直觀地顯現(xian)出來。

單純的液體培養基檢測經常受到指示劑加入量、變色范圍較小等因素的干擾。因此液體培養(yang)法和固體培養(yang)法通常一起使用，使檢測結果更加可靠。培(pei)養法的檢測時間在28天左右，時間較長。

大多數支原體的DNA中AT堿基的含量較高（55%~80%），DNA熒光染料Hoechst 33258或DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)可以結合到AT含量較高的DNA鏈上。所以在使用熒光染(ran)料染(ran)色后，被支原體污染的指示細胞除了細胞核發出熒光外，細胞表面、周圍培養基和培養皿中也含有熒光小點。

為防止檢測結果出現細胞破裂后散出DNA等不確定因素造成假陽性或不清晰的實驗結果，通常(chang)會使用待(dai)檢測樣品的(de)培養(yang)液(ye)，去感(gan)染易使支原(yuan)體增殖的(de)指示細胞（無污染(ran)的(de)Vero細胞或經(jing)藥品檢定機構認可(ke)的(de)其他細胞），故又稱指示(shi)細胞法。

對于細胞粘附性比較差的支原體（精氨酸類支原體），染色法的檢出效果較差，所以在實際檢測過程中通常將染色法(fa)和(he)培養法(fa)結合起來進行結果判定。

注：對(dui)可能引起指示細胞病變的且缺少有效中和抗(kang)體的高(gao)滴度(du)病毒樣本來說，不能使用DNA染色法進行(xing)檢測。

相較于其他PCR技術，實時熒光定量PCR法可(ke)以(yi)通過觀(guan)察熒光擴增曲線的擴增情況來實時檢測支原(yuan)體的污(wu)染(ran)情況，具有較好(hao)的特(te)異性和準確性。并且不需要(yao)在PCR擴增后(hou)再進行凝膠(jiao)電泳(yong)，縮短了(le)實驗(yan)時(shi)間，降低(di)了(le)交(jiao)叉污(wu)染的(de)風險。

雖然支(zhi)原體核酸擴增檢(jian)測(ce)(ce)法彌(mi)補了(le)培養法和DNA染色(se)法耗時長的(de)缺點，也在(zai)一(yi)定程度上增加(jia)了(le)檢(jian)測(ce)(ce)的(de)靈敏度，但因(yin)其(qi)陽性(xing)(xing)檢(jian)出率往往受(shou)到(dao)引物所能擴增的(de)支(zhi)原體種類的(de)制約，且容易受(shou)到(dao)樣品(pin)核酸提取方法、與(yu)支(zhi)原體親(qin)緣關系較近的(de)基因(yin)干擾等外源(yuan)因(yin)素的(de)影響(xiang)。所以(yi)驗證每種支(zhi)原體核酸檢(jian)測(ce)(ce)方法的(de)檢(jian)測(ce)(ce)限(Detection Limit)、特(te)異性(xing)(xing)(Specificity)、耐用性(xing)(xing)(Robustness)是(shi)非常必要的(de)。